鉴定知识

对混合斑样本进行DNA鉴定，其核心目标是将多个贡献者的DNA分型进行分离，并最终确定或排除特定个体的存在。

整个检测流程可以概括为以下五个主要步骤，其中前三个步骤与常规单源DNA样本检测基本相同，但后两个步骤（尤其是数据分析）是混合斑检验的难点和核心。

混合斑DNA鉴定检测步骤详解

第一步：样本处理与DNA提取

样本检查与预处理：

对收到的混合斑样本（如阴道拭子、床单上的精斑、烟头、饮料瓶口等）进行初步的形态学观察和记录。

根据斑迹类型，可能需要进行差异提取。这是处理含有精子细胞混合斑（最常见于性侵案件）的关键步骤。

原理：精子细胞膜和上皮细胞膜对去垢剂的抵抗力不同。

过程：先用较温和的裂解液裂解并分离出上皮细胞（富含女性DNA），剩余的精子细胞再用强效的DTT裂解液来破碎坚固的精子细胞膜，从而提取出精子细胞（富含男性DNA）。这样就能得到两个相对纯净的DNA提取液，极大简化了后续分析。

DNA提取：使用化学方法（如磁珠法、Chelex法等）从细胞中纯化出DNA，去除蛋白质、脂质等杂质，得到可用于后续分析的DNA溶液。

第二步：DNA定量

目的：精确测量提取出的DNA浓度。

重要性：为确保后续PCR扩增的效率和准确性，必须向PCR反应体系中加入最适量的DNA模板。对于混合斑，定量结果可以初步提示样本中是否存在多个贡献者（如DNA浓度异常高）。

第三步：PCR扩增与STR分型

PCR扩增：使用复合扩增试剂盒，同时扩增多个短串联重复序列 基因座。目前常用的试剂盒可以同时扩增20个以上的常染色体STR基因座，以及1个性别鉴定基因座（Amelogenin）。

PCR过程会特异性复制这些目标区域，使其数量呈指数级增长。

毛细管电泳与分型：将PCR扩增产物放入遗传分析仪中进行毛细管电泳分离。DNA片段根据大小不同而被分离。

仪器内的激光检测系统会检测到每个DNA片段上的荧光标记，最终生成一张电泳图谱，即我们通常所说的DNA分型图谱。

第四步：结果分析与解释 —— 混合斑分析的核心

这是整个流程中最复杂、最需要专业知识和经验的部分。分析人员需要解读电泳图谱，判断是否为混合斑，并推断贡献者的人数和可能的基因型。

混合斑的识别：在一个基因座的电泳图上，如果出现两个以上的峰（等位基因），则强烈提示为混合斑。例如，一个基因座正常情况下一个人最多有两个峰（分别来自父母），如果出现三峰或四峰，基本可判定为两人或以上的混合。

推断贡献者人数：

通过观察所有基因座中等位基因的最大数量来推断。例如，如果在多个基因座都观察到了四个不同的等位基因，那么最少由两个贡献者组成。

通过分析各等位基因的峰高和峰面积比例来辅助判断。如果混合比例均衡，两个贡献者的峰高/面积比应大致相当；如果比例悬殊（如1：4），则表现为一个贡献者的峰很高，另一个很低。

基因型分解：

分析人员需要根据等位基因的组合、峰高平衡等原则，尝试将每个基因座上的所有峰“分配”给不同的假设贡献者。

例如：在一个基因座上出现了等位基因A， B， C。可能的组合方式有：

贡献者1为 (A， B)， 贡献者2为 (C， C)

贡献者1为 (A， C)， 贡献者2为 (B， C)

贡献者1为 (A， A)， 贡献者2为 (B， C) 等等。

这个过程需要综合考虑所有基因座的信息，形成一套最合理的、贯穿所有基因座的基因型组合。

第五步：统计学分析与结论

似然率计算：

这是目前对混合斑鉴定结果进行统计学评估的国际标准方法。

核心思想：比较在两种竞争性假设下，出现该混合斑DNA图谱的概率比。

Hp假设（起诉方假设）：混合斑来源于嫌疑人X和未知个体。

Hd假设（辩护方假设）：混合斑来源于两个未知的个体。

LR公式：LR = Pr(E | Hp) / Pr(E | Hd)

Pr(E | Hp)：在Hp假设为真的条件下，获得现有DNA图谱证据(E)的概率。

Pr(E | Hd)：在Hd假设为真的条件下，获得现有DNA图谱证据(E)的概率。

结果解读：

LR >> 1：证据支持Hp假设（即支持嫌疑人X是混合斑的贡献者）。

LR ≈ 1：证据没有判别力。

LR << 1：证据支持Hd假设（即不支持嫌疑人X是贡献者）。

LR值会以一个巨大的数字呈现（如十亿、万亿），表明证据支持Hp假设的强度。

出具鉴定意见：

根据LR计算的结果，结合案件情况，给出科学的鉴定结论。常见的结论包括：

支持XXX个体是混合斑的贡献者。

排除XXX个体是混合斑的贡献者。

不排除XXX个体是混合斑的贡献者，但需要进一步评估（通常出现在非常复杂的混合情况下）。

总结与要点

关键步骤：差异提取（针对精液与上皮细胞混合）和混合斑图谱解释与统计学分析。

技术核心：PCR-STR技术和似然率统计模型。

挑战：当混合斑的贡献者超过两人，或者各贡献者的DNA比例严重失衡，或者存在等位基因“丢失”（即小比例贡献者的峰低于检测阈值）时，分析会变得极其复杂，需要借助专业的软件和资深分析人员的经验。